用于體視顯微鏡觀察的標(biāo)本介紹
發(fā)布人：發(fā)布時(shí)間：2014/9/4
用于體視顯微鏡觀察的標(biāo)本必經(jīng)經(jīng)過(guò)一定的準(zhǔn)備過(guò)程才能在體視顯微鏡下形成清晰的像。在入肘照明和透射照明中，對(duì)于標(biāo)本的光學(xué)要求有很大區(qū)別，在入射照明中像是由標(biāo)本的反射光所形成的，相反，在透射照明中像是由透射光所形成的，在這種情況下反射光對(duì)于像的形成不僅無(wú)益，而且會(huì)降低像的清晰度。
用入射光雙察的標(biāo)本，它的準(zhǔn)備工作十分簡(jiǎn)單，只是清潔標(biāo)本的表面并切割為適當(dāng)大小的小塊。而用透射光觀察的標(biāo)本，必須具有由于光吸收的差異而產(chǎn)生的一定反差，才能在體視顯微鏡下被觀察到。為此，標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的處理和制備過(guò)程，這種制備技術(shù)就是我們一般所說(shuō)的生物顯微技術(shù)。
從光學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，對(duì)于用透肘光觀察的體視顯微鏡標(biāo)本有如下要求:
(1)適當(dāng)?shù)暮穸?。這種厚度在較好的光學(xué)系統(tǒng)中能夠達(dá)到盡可能高的分辨力，并且與這個(gè)系統(tǒng)的場(chǎng)深相適應(yīng)。
(2)足夠的透明度。
(3)能夠形成建立在吸收差異上的足夠的反差。
實(shí)際上所有的生物學(xué)材料通過(guò)石蠟包埋、切片(成涂片)、貼附、溶蠟、透明等過(guò)程，能夠得到在厚度和進(jìn)明度上符各要求的標(biāo)本，然后通過(guò)染色程序得到一定程度的反差。
通常在透射式光學(xué)體視顯微鏡中所使用的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)組織切片，它的厚度一般為3-7μm。在這個(gè)厚度范圍內(nèi)，當(dāng)使用低倍物鏡(例如10x)觀察時(shí)，場(chǎng)深對(duì)于瓏察整個(gè)切片厚度是完全足夠的，當(dāng)使用高倍物鏡(例如100 x)觀察時(shí)，場(chǎng)深僅僅是這個(gè)切片厚度的很小部分，不斷地從上到下移動(dòng)細(xì)調(diào)可以得到切片的總體印象。因此，5-75μm厚的常規(guī)切片可以被認(rèn)為是在低放大倍數(shù)和高放大倍數(shù)理想情況之間的調(diào)和，兩者都較好地考慮到了場(chǎng)深和分辨力。同時(shí)由于種種原因，這種調(diào)和的厚度也滿足了實(shí)際工作中的許多要求，首先物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)不總是第一重要的，其次在很薄(1-25μm)的切片中生物標(biāo)本中的立體關(guān)系就看不到了，與此相反，當(dāng)使用8-10μm或者更厚的切片時(shí)，除了分辨力上可覺(jué)察的權(quán)失而外，還會(huì)引起生物標(biāo)本中不同層次的互相重處。
經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片、熔蠟、透明等處理之后的動(dòng)植物材料標(biāo)本是足夠薄和透明的了，但是反差很小，并且這種反差主要來(lái)自于折射和衍射。顯然，這種標(biāo)本在反差上是遠(yuǎn)不理想的。但是這可以通過(guò)降低折射效果給它扭蓋上“吸收物質(zhì)”，并通過(guò)吸收的差異而增大反差。在標(biāo)本與周田區(qū)城之間的折肘，可以通過(guò)把標(biāo)本封藏在加拿大樹(shù)膠或其他人工合成的封截介質(zhì)中的方法而減小。所有這些封成介質(zhì)經(jīng)過(guò)揮發(fā)或聚合使其變硬之后，它們的折射率就接近被固定或被脫水的動(dòng)植物組織主要成分的折射率。在大多數(shù)動(dòng)植物組織中這個(gè)數(shù)值為1.51-1.5.4同時(shí)用這個(gè)方法還可以消除蓋玻片下面的反射引起的閃光。
已經(jīng)應(yīng)用了一個(gè)多世紀(jì)，并且能夠給體視顯微鏡標(biāo)本帶來(lái)較好反差的最有效方法是染色。一般沒(méi)有染色的生物標(biāo)本，特別是當(dāng)放里在具有與生物標(biāo)本相近折射率的介質(zhì)中時(shí)，像的反差是很小的。在染色的標(biāo)本中，像的反整的增大是建立在染料選擇性分布的基礎(chǔ)上。染色與未染色標(biāo)本在反差上有巨大差異。
生物切片經(jīng)?？葙N在具有26x76mm標(biāo)準(zhǔn)尺寸和1.1-1.3mm厚度的毅玻片上，載玻片的兩面應(yīng)是平行平面。對(duì)于毅玻件厚度的要求不是很嚴(yán)格的，但是當(dāng)它的厚度超過(guò)一些較高矯正程度集光器的自由工作距離時(shí)，載玻片厚度對(duì)于聚焦光裸以及在物體平面上形成視場(chǎng)光門(mén)的像就變得宜要了。對(duì)于這種情況，厚度為0.9-1.O mm的載玻片是比較合透的。至于蓋玻片在第三章中已講過(guò)了，這里不再重復(fù)。
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